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循環腫瘤細胞臨床應用的研究進展

作者:傅瀟 姚煜

作者單位:西安交通大學第一附屬醫院腫瘤內科

來源:中國癌症防治雜誌,2020年6月第12卷第3期​專家簡介

姚煜,教授,主任醫師,博士研究生導師,現任西安交通大學第一附屬醫院腫瘤內科副主任。主要學術兼職:中國臨床腫瘤學會(CSCO)理事、CSCO惡性黑色素瘤專業委員會常務委員、CSCO肺癌專業委員會委員、吳階平腫瘤多學科診療委員會常務委員、中國醫藥教育協會腫瘤化學治療專業委員會副主任委員、陝西省抗癌協會理事、陝西省抗癌協會化療專業委員會主任委員、陝西省抗癌協會腫瘤標誌物專業委員會副主任委員、陝西醫學會腫瘤內科專業委員會常務委員、陝西省抗癌協會抗癌藥物專業委員常務委員、JCO中文編委等。從事腫瘤侵襲轉移與腫瘤耐藥的基礎與臨床研究。主持陝西省科技攻關項目1項,陝西省國際科技合作重點項目4項,陝西省國際合作項目、吳階平基金、西安交通大學學科綜合交叉類科研項目各1項,獲國家發明專利1項。以第一或通信作者發表SCI收錄論文15篇,參編多種專著。

循環腫瘤細胞(circulating tumor cell,CTC)是指在腫瘤形成和發展過程中,從實體腫瘤病變脫落並進入血流循環的腫瘤細胞。CTC是腫瘤發生發展的直接證據,真實反映了腫瘤負荷和特征,並可以提示療效及預後。既往研究認為CTC的出現即提示腫瘤轉移的發生,然而近期研究在早期腫瘤患者外周血中也發現了CTC的存在,因此CTC也可用於早期診斷。此外,與循環腫瘤DNA/RNA和腫瘤細胞來源外泌體相比,CTC還可進行RNA和蛋白組學的表達譜分析、體外細胞形態和功能研究以及信號共定位展示等,為個體化治療提供了堅實基礎。雖然CTC檢測具有方便、快捷、無創和可重複采樣等優勢,但是外周血中CTC數量非常少(轉移性乳腺癌中每106~108個有核細胞僅有1CTC),通常需要富集之後再進行檢測或分析。以往因受限於提取和富集技術,CTC並未得到進一步研究和應用。直至近十幾年,基於CTC物理特性和分子生物學特征的分離、提取和富集技術的發展,CTC才被應用於臨床,並獲批為腫瘤標誌物,在腫瘤的早期診斷及療效和預後評估中凸顯優勢,現就CTC的發展曆史、提取技術及臨床應用研究進展進行闡述。

 

01、CTC發展概況

1869Thomas Ashworht首次報道了CTCs的存在。之後Stephen Paget等提出了種子與土壤假說,認為腫瘤轉移的機製是癌細胞通過血液和淋巴擴散至身體不同地方,從而誘導周圍正常細胞形成腫瘤微環境。1998年,CTC首次從血液中分離,並被證實與病理分期相關 。此後,CTC才被應用於臨床。發表在N Engl J Med 的一項前瞻性研究結果提示CTC數目是預測轉移性乳腺癌無進展生存期(progression-free survival,PFS)和總生存期(overall survival,OS)的獨立預後因子。自此CTC被認為是腫瘤轉移的前兆,即CTC是腫瘤轉移病灶(血行轉移)形成的種子細胞,部分細胞可在循環中存活,並在遠端器官與新的微環境相互作用下形成轉移灶。因此2007年,CTC被美國臨床腫瘤學會(ASCO)納為腫瘤標誌物。然而,2010年發表在 J Clin Invest 的研究表明,腫瘤早期也發現CTC的存在。基於此,2012年病理學年鑒不再認為血液中發現CTC僅提示腫瘤轉移的前兆。目前隨著高通量測序技術和單細胞測序技術的出現,CTC全外顯子測序和單細胞測序將有助於更進一步揭示腫瘤異質性和腫瘤演進過程。

 

02、CTC分離、富集和檢測技術

CTC的應用與分離技術發展密切相關。第一代CTC分離技術主要依靠CTC物理特征,如基於細胞大小和密度法是通過膜過濾、密度梯度離心等方法進行分離。這一類方法不依賴CTC抗原表達情況,操作方便,但因CTC變形性以及密度差異易導致漏檢,影響分離效果。第二代分離技術是基於CTC表麵抗原的表達,利用免疫磁珠進行分選。從本質上講,這種方法可以分為兩大類:基於特定抗原的表達捕獲CTC細胞的陽性選擇和耗盡給定樣品中非CTC的所有細胞的陰性選擇。目前唯一獲得FDA批準的Cell Search係統就是利用表麵抗原的表達進行CTC分選。但該方法受上皮標誌物表達影響。到目前為止,仍未有公認和普適性的腫瘤表麵抗原標誌物,原因有以下幾方麵:並非所有腫瘤細胞均表達上皮標誌物,例如黑色素瘤並不表達上皮標誌物。腫瘤細胞入血時會發生上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal translation,EMT),下調上皮標誌物表達量,導致磁珠對CTC的吸附能力下降,影響檢出率。在正常情況下,有極少量的正常上皮細胞脫落入血,或者腫瘤患者在進行手術或其他創傷性治療後,上皮細胞可進入血液,導致假陽性的出現。第三代分離技術是利用芯片,包括CTC芯片和微流控芯片等對CTC進行分離、富集。該技術並不是一種獨立的分離技術,而是優化各類技術的一種手段。該技術分離原理多樣,包括基於腫瘤細胞大小、流體力學特性、表麵分子標記以及去除白細胞進行陰性富集等。第一代芯片以CTC-Chip為代表,包括Captura公司的GEDI-ChipBiocept公司的OncoCEE微流微柱富集,主要是利用CTC與血細胞生化特性的差異,在芯片中設置微柱陣列將CTC從血液中分離出來。然而,微柱設計比較複雜,難以進行高通量生產。第二類芯片是以HB-Chip為代表,包括GEM-Chip、GO-Chip以及BioFluidica公司的Modular Sinusoidal Microsystem微流表麵富集,此類芯片使用抗體包被捕獲CTC,能更高效地捕獲CTC,捕獲效率約為90%,更適合大規模生產。但是,這類芯片所捕獲的CTC被固定在抗體包被的裝置表麵,難以進一步分離。雖然胰蛋白酶能將CTC從裝置表麵消化並釋放,但是經胰蛋白酶消化釋放的CTC可能失去很多有意義的表麵受體。第三代芯片以CTC-iChip為代表,包括Ephesia公司的Ephesia,Cynvenio公司的Liquid BiopsyFluxion公司的Isoflux微流免疫磁珠富集,這類芯片將免疫磁珠和微流控富集技術相結合,捕獲效率與第二代芯片相當。以上芯片均基於CTC化學特性或表麵生物標誌物進行分離,目前也有基於CTC物理特性進行分選的分離技術,包括基於細胞大小和變形性差異的芯片技術,基於細胞力學性質的芯片技術和基於細胞介電性質的雙向電泳技術等。

CTC檢測主要包括從蛋白、染色體、DNARNA水平實現對腫瘤細胞的定性工作。在蛋白水平,利用免疫熒光標記,如選用CD45-/CK+/DAPI+作為腫瘤細胞定性的標誌物,EPISPOT方法可以區分凋亡和有活性的CTC。細胞骨架蛋白對上皮細胞具有特異性,因此細胞角蛋白家族成員(CK8、CK18CK19)也成為檢測上皮表型CTC的標誌物。鑒於上皮標誌物的局限性,針對幹細胞標誌物(CD133),間充質標誌物(波形蛋白)和腫瘤組織特異性抗原,例如前列腺特異性抗原(PSA)、乳腺特異性抗原乳珠蛋白等也被用於CTC檢測。在染色體水平,熒光原位雜交技術能檢測特定染色體的擴增情況和靶基因的擴增情況;在DNA水平,基因測序和ARMS可以檢測到豐度低至0.1%~1.0%的突變基因;在RNA水平,基因表達圖譜和qPCR技術可檢測CTC基因表達水平。


03、CTC對腫瘤早期診斷的作用

傳統的影像學檢查難以發現腫瘤早期病灶。當病灶<1 cm時,CTC檢測有可能早於影像學或臨床表現發現腫瘤,從而實現早期診斷。法國巴斯德醫院一項研究納入了168例慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)患者、42例吸煙者和35名健康人,研究發現168COPD患者中CTC陽性的5例患者在隨訪的5年內均被診斷為肺癌。基於此項研究結果,LEROY等在法國21個研究中心開展了一項前瞻性、非隨機、多中心、雙盲AIR研究(NCT02500693),以期在肺癌高危人群(吸煙者、COPD患者等)中探討CTC對肺癌發生的預測作用。近年研究還發現具有特定核型或分子標記的CTC在腫瘤早期診斷中發揮了重要作用。一項納入136例新診斷的非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者、142例肺部良性疾病患者和32名健康受試者的臨床研究,通過陰性富集技術和FISH技術檢測8號染色體擴增型CTC,發現CTC數量能較好地區分NSCLC及肺部良性疾病患者。CTC8號染色體的計數和非整倍性還在鼻咽癌早期診斷中有一定臨床意義。近期的一項研究在低劑量CT提示肺部結節的患者中,以組織活檢結果作為對照,通過檢測10q22.3/CEP103p22.1/3q29 FISH探針標記的CTC,與組織活檢相比,10q22.3/CEP103p22.1/3q29標記的CTC診斷肺癌的準確性為94.2%,敏感性為89.0%,特異性為100.0%。在乙肝相關肝細胞癌中,幹細胞樣CTC對早期肝細胞癌診斷具有較高的敏感性(82.1%)和特異性(94.2%),並且能區分肝癌、乙肝和肝硬化。此外,CTC與其他腫瘤標誌物聯合也有助於提高腫瘤早期診斷的準確性。一項納入155例前列腺癌患者的研究發現,PSA、CTC12基因檢測平台結合後,診斷的準確性達92.7%,CTC還與更高的Gleason評分和高風險相關。CTC與包含CCNE2、DKFZp762E1312、EMP2、MAL2、PPICSLC6A86基因檢測平台相結合也有助於女性生殖係統腫瘤的早期診斷,聯合診斷宮頸癌的準確率達44%,對子宮內膜癌診斷準確率達64%,對卵巢癌診斷準確率為19%。

雖然CTC最早被認為是腫瘤轉移的早期分子標誌,但是隨著CTC在早期腫瘤患者外周血中的發現,越來越多的研究提示CTC不僅對早期腫瘤診斷具有重要的作用,而且與腫瘤分級和TNM分期也具有相關性。


04、CTC在腫瘤療效和預後評估中的作用

CTC已被認為是一個可靠的預後指標,無論在手術、化療、放療、靶向治療及免疫治療過程中都顯示出了良好的療效和預後評估價值。

在手術治療方麵,LI等在可手術切除的NSCLC患者中發現,術前外周血和靜脈血CTC計數是治療失敗時間(time to failure of strategy,TFS)和OS的獨立危險因素,而術中首先離斷流出靜脈可減少腫瘤細胞的播散,改善NSCLC患者的生存結局。也有研究證實術前肺靜脈CTC陽性預示更高的疾病複發風險。一項納入200例胰腺癌患者的前瞻性CLUSTER研究提示,無論是否接受新輔助化療,術前CTC計數與胰腺癌術後複發顯著相關。因此,術前CTC檢測不僅可預測無疾病生存期,也為手術方式和術後治療方案的選擇提供依據。

在化療方麵,有研究報道晚期NSCLC患者化療後CTC數量下降與更長的PFS顯著相關,而治療前高CTC計數與更差的病理分期和更高轉移率相關。在乳腺癌中,新輔助治療前CTC陽性被認為是獨立預後因素,結合pCR有助於識別需治療幹預的乳腺癌患者。SPARANO等 在Ⅱ~ⅢHER2陰性接受術後輔助治療的乳腺癌患者研究中也發現,CTC與臨床複發率呈正相關。一項納入了430例接受化療的轉移性結直腸癌的前瞻性、多中心臨床研究也證實,治療前和治療過程中的CTC數量是轉移性結直腸癌患者PFSOS的獨立預測因素。動態監測CTC數量變化對療效評估和預測預後具有重要作用。除CTC數量外,在轉移性前列腺癌中,CTC中不同雄激素受體(AR)剪切體也被證實與卡巴他賽療效相關。

在放療方麵,迄今最大規模的綜合了來自美國國家癌症數據庫的1 697例和SUCCESS研究的1 516例早期乳腺癌患者的研究發現,放療顯著延長了CTC陽性患者的局部無複發生存期(local recurrence-free survival,LRFS)和OS。期隨機CONVERT研究(NCT00433563)則證實了CTC數量預測接受放療局限期小細胞肺癌的療效。PREDICT-HN研究(NCT03491176)提示,在頭頸部腫瘤中,CTC聯合MRI能更好評估放療療效,並為後續放療劑量選擇提供依據。在局部晚期直腸癌中,CTC數量變化和CTC中胸苷酸合酶(TYMS)和切除修複蛋白RAD23同係物BRAD23B)表達變化與接受新輔助同步放化療後的pCR相關,檢測CTC數量和TYMS、RAD23B表達的變化能夠預測局部晚期直腸癌患者對新輔助放化療療效,為下一步治療提供決策。由此可見,CTC不僅能夠預測放療療效,還可能為優化放療人群和放射劑量提供依據。

在靶向治療方麵,表達特定靶點CTC的變化能夠預測靶向治療療效。在41例接受培美曲塞聯合厄洛替尼的EGFR突變晚期NSCLC患者中,78%的患者在治療基線的外周血中檢測到CTC,且高水平CTC與不良預後相關;治療過程中,CTC水平下降與療效呈正相關。JIANG等 在232例一線接受EGFR-TKI治療的EGFR突變晚期NSCLC患者中證實,葉酸受體陽性CTC計數可用於動態監測和預測EGFR-TKIs療效和患者預後。PAILLER等通過FISH技術檢測18ALK陽性的NSCLC患者CTC中的ALK重排情況,發現CTC與組織ALK重排具有較高的一致性,認為CTC可作為ALK陽性NSCLC的補充診斷,同時監測ALK抑製劑療效。新近研究還發現CTC可用於探索ALK抑製劑的耐藥機製。CTC不僅代表了腫瘤細胞的生物學和基因組學特性,而且反映了腫瘤的異質性。在納入19ER+/HER2-乳腺癌患者的研究中發現,84%的患者在治療過程中獲得了表達HER2CTC,隨後的功能學實驗發現,HER2+CTC增殖能力更強,且不依賴HER2通路;而HER2-CTCNotch通路和DNA損傷通路被激活。之後也有研究報道HER2+CTC的轉移性HER2陰性乳腺癌患者能從HER2靶向治療中獲益。

在近年來興起的免疫治療中,發現CTC數量和CTC表麵PD-L1表達的動態變化與Nivolumab療效相關。然而,也有研究報道在接受Nivolumab治療的NSCLC中未發現治療前PD-L1+CTC與預後有相關性,但對Nivolumab原發耐藥的患者治療基線時具有更高的PD-L1+CTC數(≥1%)。在頭頸鱗癌中,PD-L1+CTC提示更短的PFSOS。在肝癌、胃癌和胃食管結合部癌中,檢測CTC表麵PD-L1的表達也可用於預測PD-1抑製劑SHR-1210的療效。與腫瘤組織中PD-L1表達情況相似,CTCPD-L1表達與免疫檢查點抑製劑療效的關係也仍需進一步探索。除PD-L1外,CTCMART-1、MAGE-A3PAX3表達也被證實與免疫治療療效相關。此外,CTC與免疫細胞活性、血小板等腫瘤微環境檢測相結合,能共同分析腫瘤複發轉移風險,有利於更全麵評估預後。

CTC數量外,CTC簇、CTC染色體改變、基因突變和基因表達、細胞分型等也被證實與腫瘤療效和預後相關。CTC簇被認為是乳腺癌轉移的寡克隆前體, 且能通過改變DNA甲基化,促進乳腺癌轉移。CARTER等探討了CTC拷貝數畸變在預測小細胞肺癌化療耐藥中的作用,發現CTC拷貝數畸變區分化療敏感組或耐藥組的準確率達83.3%,且兩組患者的PFS差異有統計學意義。在結直腸癌CTC中,鳥苷酸交換因子表達升高與較短的PFS呈正相關。在胰腺癌中,不同CTC細胞分型也與預後相關:上皮型CTC的存在與不良預後相關,可作為獨立的預後預測因子,同時上皮型、間質混合型CTC與複發密切相關。在多發性骨髓瘤中,二代測序結果表明CTC和對應的骨髓細胞中的基因表達具有高度一致性,CTCCD44的表達與腫瘤轉移相關。不僅如此,在乳腺癌中,全基因組測序結果提示CTC中信號量4D與乳腺癌腦轉移發生相關 。因此,根據CTC染色體和基因突變以及表達情況對CTC進行分型,確定具有特殊臨床意義(如耐藥、轉移、複發等)的CTC亞型,能夠為後續CTC單細胞研究提供更明確的指導意義。


05、小結

CTC可作為分析患者腫瘤生物學特征的樣本,目前研究認為CTC有助於及時發現腫瘤的生物學變化,並為及時調整治療方案提供參考,從而實現實時、個體化治療,是目前具有發展潛力的腫瘤無創診斷和實時療效監測手段。與傳統的影像學診斷、內窺鏡檢查以及病理學診斷相比,CTC對發現疾病變化更敏感,能更科學、迅速地評價療效。2019NCCN乳腺癌指南已引入cM0i+)分期,確認CTC在腫瘤分期係統中的重要意義。我國也發表了《循環腫瘤細胞在結直腸癌中的應用專家共識》,明確了CTC在動態評估結直腸癌患者疾病狀態、早期篩查、預後評估及治療反應監測中的重要作用。同時得益於分子生物學和生物信息學的發展,CTC的研究和應用將不僅僅局限於疾病篩查、診斷、療效和預後評估,CTC細胞生物學、分子生物學和基因組學的特征已受到了越來越多的關注。此外,還有研究將CTC進行改造,使其表達TGF-β;或將CTC作為藥物運輸載體,靶向殺傷腫瘤細胞,且發現改造後或攜帶藥物的CTC具有抑製腫瘤效應,但是這些研究仍在臨床前階段,需要更進一步探索。

 

2020年12月4日 10:07
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